細(xì)胞培養(yǎng)中的注意事項(xiàng)
1 冷凍管應(yīng)如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意**，預(yù)防冷凍管之爆裂。
2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。
3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。
4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。
6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 %或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
8 培養(yǎng)基中是否須添加***？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何***。
9附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4Na。**次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。
10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

12 細(xì)胞之接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。
13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)*常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 -95%原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。
14 DMSO之等級(jí)和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO等級(jí)，必須為Tissue culture grade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌狀況，**次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于4C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。
15 冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一：冷凍管置于4 C 30~60分鐘 → (-20 C 30分鐘) → -80 C 16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 C 至–80 C 以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。*-20 C 不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/mlvial為宜。
17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類可分成**、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之*好方法。
18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？
加入相應(yīng)***，直接**后丟棄之。
19 支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。
20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
21 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？
直接**后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。
22 CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
23 為何培養(yǎng)基保存于4C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值會(huì)越來越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于4 C 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。
24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。
25購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
26 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80C太久。
27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。
28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，優(yōu)選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)*好優(yōu)選AIMV（12005）培養(yǎng)基（SFM）。
29 L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有*終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
30GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅**20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有*小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類**的作用，（特別是雌**）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
33目錄上說，Hank’s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。
34二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？
二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。
35當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加***時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些***。在無血清培養(yǎng)條件下，***不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。
36一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和***時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍?**和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
37大部分添加物和試劑*多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。
38在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。