SD乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法

1  材料
1.1 動物
出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。
1.2 試劑
低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青鏈霉素、碳酸氫鈉液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酒精。
培養(yǎng)液：培養(yǎng)液(DMEM，新生牛血清，青鏈霉素)。
1.3 手術(shù)器械和儀器
鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養(yǎng)皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心臟組織)、100 ml 廣口瓶兩個(分別裝碘酒和酒精棉球)、500 ml 燒杯、250 ml 錐形瓶、15 ml和 50 ml 的離心管，磁力攪拌器和攪拌子(或者水浴振蕩器)、150-200 目尼龍篩網(wǎng)和針式濾器。
2  方法
2.1 將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度，并放置于 37℃水浴中溫育好。
2.2 解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球**后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復(fù)以上過程。取材完畢后，撤掉取材的手術(shù)器械。注：為了保證心肌細(xì)胞的活力，取心的操作過程盡量快，另外，*好把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺上或者預(yù)冷的平衡鹽液中。
2.3 用**套手術(shù)器械進(jìn)行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個預(yù)先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養(yǎng)皿中(或者其它合適容器中，視個人習(xí)慣)，加少許 0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶中，補(bǔ)加胰酶至終體積10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中(可以用一個**的500 ml燒杯，裝好無菌的蒸餾水，加夠水量，水位線稍低于250 ml錐形瓶的刻度線即可，過少則溫度會不均勻，過高容易污染。打開磁力攪拌器電源，預(yù)先將水溫調(diào)節(jié)到 37℃)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 rpm左右，消化15 min(務(wù)必保證水浴溫度恒定在 37℃，并且消化時間不超過 15 min)?；蛘撸绻捎玫氖撬≌鹗幤鞯脑挘挥眉訑嚢枳樱苯臃旁谒≌鹗幤髦邢嗫?，轉(zhuǎn)速和消化時間相同。
2.4  從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細(xì)胞和成纖維類細(xì)胞。
2.5  加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機(jī)械分散細(xì)胞(組織消化后會成為粘稠的膠體狀)，注意：不要過分吹打，否則會導(dǎo)致組織過度消化，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數(shù)目少(比如 5、6 只的時候)，消化時間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過度。上述消化處理的同時，往一支 50 ml 的一次性無菌離心管中加入 20 ml 預(yù)冷的含 10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺上。消化處理之后，小心移出上清轉(zhuǎn)至上述加有培養(yǎng)液的離心管中，**次消化收集的分離出的細(xì)胞，**次消化結(jié)束后；繼續(xù)**次消化，余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。
2.6  重復(fù) 2.5 消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數(shù)的組織塊(不含棄去消化液的那次)。
2.7  第 1、2 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網(wǎng)后，一起離心；第 3、4 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網(wǎng)后，一起離心。*后，分別用 8 ml含 20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細(xì)胞，接種到一個 75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中 1.5 小時后，取出，棄貼壁細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)，將未貼壁的細(xì)胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5-6x105個/ml，接種到目的培養(yǎng)器皿中。
2.8  一般不用加BrdU，如果培養(yǎng)時間長(發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞也極少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細(xì)胞增殖。加了BrdU，心肌細(xì)胞搏動的持續(xù)時間會更長。
2.9  接種后 24 小時，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細(xì)胞一次，以去處未貼壁的細(xì)胞(部分細(xì)胞會在 24 小時后貼，結(jié)果很多細(xì)胞重疊生長)，再更換培養(yǎng)液，即可。可以按照實驗需要在培養(yǎng) 48 h 或 72 h 后施加處理因素。
3  結(jié)果
    心肌細(xì)胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在 24 h左右基本貼壁，此時細(xì)胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細(xì)胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細(xì)胞有聚集傾向，細(xì)胞搏動效果較好， DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應(yīng)該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說明細(xì)胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻(xiàn)的培養(yǎng)方法加以補(bǔ)充。鑒定的*簡單的辦法就是搏動與否，注意：當(dāng)搏動比較微弱的時候，在 10 倍物鏡下可能看不到搏動，換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的*好的辦法就是看心肌細(xì)胞的純度和搏動能力。另外，心肌細(xì)胞表達(dá)肌動蛋白，可以作為鑒定，但不是**的特征性指標(biāo)，因為平滑肌細(xì)胞也表達(dá)。
4  討論
    乳鼠心肌細(xì)胞屬于原代生長細(xì)胞，培養(yǎng)過程較為繁瑣。文獻(xiàn)上有多種濃度胰酶消化方法，0.06%濃度的胰酶對細(xì)胞損害較小，但這個濃度消化所需時間較長。采取多次反復(fù)低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細(xì)胞。利用心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁 1.5h，充分去除成纖維類細(xì)胞，達(dá)到純化的目的。成纖維細(xì)胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀，并且會增殖，不搏動，很好和心肌細(xì)胞鑒別。消化和吹打一定不要過度，是保證心肌細(xì)胞活力*重要的一個原則。而接種密度(一般不低于 105/ml)，也將影響到心肌細(xì)胞的搏動及同步化搏動。